細(xì)胞的離心分離基礎(chǔ)和分離實(shí)例

更新時(shí)間：2011-08-15

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利用細(xì)胞的特性[尺寸、密度、電特性、表面（抗原）性質(zhì)，光散射特性等等]可以用各種方法分離和純化細(xì)胞。離心分離是利用不同尺寸和密度的細(xì)胞在離心場(chǎng)中沉降行為的不同，從組織勻漿或血液中分離純化的技術(shù)。用離心技術(shù)分離和純化細(xì)胞主要依賴(lài)的方法是差分離心、速率－區(qū)帶密度梯度離心、等密度離心和利用特殊轉(zhuǎn)頭的細(xì)胞浮選離心。

下面的表格概括了細(xì)胞離心分離純化主要方法：（文獻(xiàn)1）

分離依據(jù)	方法名稱(chēng)	離心加速度	梯度形狀	使用工具	局限性	優(yōu)點(diǎn)
細(xì)胞密度（ρ）	平衡等密度離心	比較高（100 ～ 30,000 × g）	連續(xù)或不連續(xù) 梯度	甩平轉(zhuǎn)頭，固定角轉(zhuǎn)頭，區(qū)帶轉(zhuǎn) 頭	離心力較大，等密度純樣品區(qū)帶可能重疊	細(xì)胞易聚合；應(yīng)用面較面較廣
沉降速度（細(xì)胞平均直徑d 密度ρ）	差分離心	1 ～ 300 ×g	無(wú)梯度	角式為主	低分辨率	快速，簡(jiǎn)易
	單位重力加速度沉降	1g	連續(xù)梯度	特殊分離容器	容量50 × 10⁶個(gè)細(xì)胞，特殊裝備，時(shí)間長(zhǎng)	簡(jiǎn)單，價(jià)廉
	速率－區(qū) 帶離心	20 ～ 1 ， 000×g	連續(xù)梯度，線(xiàn)性或等速度沉降梯度，ρ梯度介質(zhì)≤ρ細(xì)胞	甩平轉(zhuǎn)頭或區(qū)帶轉(zhuǎn)頭	中等分辨率，容量范圍寬	大容量用區(qū)帶轉(zhuǎn) 頭，小容量用甩平轉(zhuǎn)頭，后者操作簡(jiǎn) 單
	離心浮選	100 ～ 3,000×g	無(wú)梯度	細(xì)胞浮選轉(zhuǎn)頭（日立或 Beckman）	裝置費(fèi)用高	快速，高分辨率，處理量較大

細(xì)胞離心分離純化概述：

1. 利用細(xì)胞密度差異進(jìn)行分離：

一般的做法是在連續(xù)或者不連續(xù)（階梯）梯度液上表面鋪樣品，梯度的范圍應(yīng)該包含被分離的細(xì)胞的密度，經(jīng)過(guò)離心達(dá)到平衡后各種細(xì)胞沉降在它們各自的等密度區(qū)形成比較純的單一細(xì)胞分布區(qū)帶。這種等密度離心法可以用于制備或分析用途。用于制備時(shí)要注意在勻漿中可能有多種不同密度的細(xì)胞，如果它們的密度差很小，離心后會(huì)造成各個(gè)細(xì)胞區(qū)帶之間的重疊。因此要優(yōu)先考慮利用細(xì)長(zhǎng)離心管，合適的密度范圍；較少的加樣量（離心管容量的2％～3％）；或者用同一個(gè)甩平轉(zhuǎn)頭進(jìn)行2～3 次分離；每一次分離的zui大、zui小密度梯度差減少（即減少梯度斜率；分別用凸指數(shù)及凹指數(shù)梯度曲線(xiàn)進(jìn)行分離；用不同的等滲液改變不同細(xì)胞在梯度介質(zhì)中的浮密度（文獻(xiàn)2）。

在離心管中細(xì)胞勻漿可以鋪在預(yù)形成的連續(xù)或不連續(xù)梯度液的上部或鋪在梯度液的中間某一位置，后者可以在離心過(guò)程中讓部分密度較小的細(xì)胞上浮，讓一些密度較大的細(xì)胞沉降，減少了沉降距離，從而縮短了離心時(shí)間。

不連續(xù)的階梯梯度常用于血細(xì)胞分離或肝細(xì)胞分離，作血細(xì)胞分離時(shí)梯度材料可選擇Ficoll-metizoate，肝細(xì)胞分離可選擇Nycodenz 或metrizamide （文獻(xiàn)3）。

2. 根據(jù)不同細(xì)胞的沉降速度差異進(jìn)行分離：

由于細(xì)胞在梯度介質(zhì)中的沉降速度和細(xì)胞直徑的平方成正比，和細(xì)胞與介質(zhì)密度差一次方成正比（參考講座文獻(xiàn)2－“實(shí)驗(yàn)離心技術(shù)的基本計(jì)算”）所以影響沉降速度的首要參數(shù)是細(xì)胞尺寸，其次才是密度。

沉降速度，ν的單位是（厘米/秒）

公式中 d 為細(xì)胞直徑（cm）

σ為細(xì)胞密度（克/cm³） η為介質(zhì)粘性系數(shù)

ρ為梯度介質(zhì)密度（克/cm³） ω為轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)角速度

r 為細(xì)胞所在位置與旋轉(zhuǎn)中心的距離（cm）

ⅰ. 差分離心：

在不存在密度梯度條件下分離細(xì)胞是這種方法的主要特點(diǎn)，差分離心可以是利用地球重力（1g），也可以是利用低速離心分離組織勻漿。在重力或離心力作用下一些比較大的細(xì)胞沉降速度較快，當(dāng)它們已變成沉淀時(shí)，大部分比較小的的細(xì)胞由于沉降速度慢而仍留在上清液中。很明顯在大的細(xì)胞變成沉淀時(shí)一部分接近離心管底的較小細(xì)胞在離心力也已變成沉淀，*次離心可以使zui大顆粒細(xì)胞全部沉淀但沉淀中少量的較小細(xì)胞降低了分辨率和純度。我們可以用*次離心同樣轉(zhuǎn)速和時(shí)間將*次沉淀稀釋后再離心（每次都要用同樣的緩沖液稀釋?zhuān)ㄟ@叫在離心機(jī)中“洗”），重復(fù)數(shù)次可以得到較純的大顆粒沉淀。各次上清液合并以更高轉(zhuǎn)速離心，重復(fù)以上過(guò)程數(shù)次，就可以得到各種較純的不同大小的顆粒的沉淀。如果利用某些特殊梯度材料（如dextran percoll （,）可以用（, ）小的離心次數(shù)得到較好的結(jié)果。（文獻(xiàn)4）。

ⅱ. 依賴(lài)重力加速度沉降：

不用離心機(jī)，將細(xì)胞懸液鋪在預(yù)形成密度梯度上表面，在重力作用下細(xì)胞沉降。一般設(shè)計(jì)的密度梯度采用較小的密度變化范圍，其zui大密度小于密度zui大的細(xì)胞密度。不同密度的細(xì)胞以很慢的速度按不同層次沉降。在zui大密度細(xì)胞達(dá)到底部之前進(jìn)行分部收集。（收集的方法參照“離心技術(shù)講座”文章3a）

ⅲ. 利用速率－區(qū)帶密度梯度離心法分離細(xì)胞：

在本質(zhì)上與重力沉降是一樣的，但是利用離心場(chǎng)來(lái)減少分離的時(shí)間。小容量樣品用甩平轉(zhuǎn)頭，大容量樣品用區(qū)帶轉(zhuǎn)頭，對(duì)于較少數(shù)量的細(xì)胞（10⁶～10⁸），并且不同細(xì)胞的沉降速度有較大差異，用甩平轉(zhuǎn)頭離心分離可以得到很滿(mǎn)意的結(jié)果。對(duì)于較大數(shù)量的細(xì)胞（＞10⁹）可以考慮利用區(qū)帶轉(zhuǎn)頭。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭操作是離心技術(shù)中比較復(fù)什的分離工藝，需要較熟練的操作人員，細(xì)心的工作才能得到成功。由于在區(qū)帶轉(zhuǎn)頭中離心分離不存在用離心管分離時(shí)產(chǎn)生的壁部效應(yīng)（Wall effect）參考加離心技術(shù)講座文獻(xiàn)3），可以一次離心收獲大量比較純的細(xì)胞。

曾有人在甩平轉(zhuǎn)頭的吊桶中加特殊的適配器（套管）來(lái)分離純化少量的細(xì)胞（＞5 ×10⁷），提高了分離的純度（文獻(xiàn)5）。

如果不同細(xì)胞間尺寸差別不大，在離心場(chǎng)中沉降速度差別不大；或者需要制備大量的細(xì)胞用這個(gè)方法就不太合適。

iv. 離心浮選

利用一個(gè)特別的錐形轉(zhuǎn)頭，錐頭方向與離心力方向相同，樣品從錐頭進(jìn)入，利用離心力在圓錐形離心管中對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的逆流效應(yīng)，可以有效地分離各種細(xì)胞（如各種培養(yǎng)細(xì)胞，酵母細(xì)胞，各種血細(xì)胞，受精卵等等）離心浮選轉(zhuǎn)頭一般配備在低速或高速低溫離心機(jī)中（如Hitachi 的R5E 離心浮選裝置，Beckman 的JE-6B 離心浮選系統(tǒng)）由于樣品是從圓錐頭部壓入，每種細(xì)胞都受到離心力和由于錐度形成的流速梯度產(chǎn)生的反向力，不同形狀、尺寸、不同密度的細(xì)胞在錐形離心室中不同位置達(dá)到力的平衡從而形成不同種類(lèi)細(xì)胞的區(qū)帶，按順序從錐室大頭排出。

這個(gè)方法的特點(diǎn)是

l 不需要制備密度梯度；

l 可以分離10⁷～10⁹個(gè)細(xì)胞；

l zui使用于分離平均尺寸為2μm~50μm 的細(xì)胞；

l 由于錐形離心管用透明材料制成，在離心室門(mén)蓋上可以安裝透明窗用于觀(guān)察分離情況并可以裝置攝像機(jī)通過(guò)屏幕觀(guān)察分離過(guò)程；

l 加樣泵有較大的流量1～120 毫升/分，可以在很短時(shí)間內(nèi)用較低的轉(zhuǎn)速（zui高

不超過(guò)5,000rpm）成功分離各種細(xì)胞；

l 不損傷細(xì)胞；

l 很高的分辨率；

l 設(shè)備投資很高，操作者需培訓(xùn)積累操作經(jīng)驗(yàn)。因此應(yīng)用受到很大限制。

3. 用于細(xì)胞分離的密度梯度

在講座3 中已較詳盡地?cái)⑹隽嗣芏忍荻炔牧希荻刃螤睿荻入x心等問(wèn)題，對(duì)于細(xì)

胞離心分離，對(duì)密度梯度材料還有一些特別重要的提示：

l 對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性；

l 可以配制等滲液；

l 不會(huì)滲入細(xì)胞內(nèi)部；

l 離心后作分部收集，易從收集液中除去分離介質(zhì)（如透析）；

l 較低的粘性系數(shù)。

用于細(xì)胞分離的梯度材料是：Percoll, Nycodenz, Ficoll, metrizamide 和小牛血清白蛋白。它們的性質(zhì)已在講座文獻(xiàn)的（3），（3）a，（18）中已說(shuō)明。

細(xì)胞分離常用的梯度可以是線(xiàn)性的，非線(xiàn)性的（凸指數(shù)或凹指數(shù)）連續(xù)的或不連續(xù)的，梯度制備方法參考講座文獻(xiàn)3（a）。

需要指出的是細(xì)胞離心配置的梯度液必須是等滲的，沿整個(gè)離心管長(zhǎng)度方向滲透壓變化要小于10％，也就是說(shuō)細(xì)胞在沉降過(guò)程中收縮和膨脹都非常小，它們的基本性狀和離心分離前基本一致。梯度材料研制和生產(chǎn)廠(chǎng)對(duì)于配制各種等滲液都提供了詳細(xì)資料。（講座文獻(xiàn)18）

4. 細(xì)胞離心分離過(guò)程中常常遇到的一些問(wèn)題

i. 細(xì)胞聚集：

細(xì)胞聚集后在離心過(guò)程中的沉降行為與單個(gè)細(xì)胞*不同，因此出現(xiàn)細(xì)胞聚集會(huì)影響分離純度。避免的方法是添加一些防止粘結(jié)的成分如小牛血清白蛋白，脫氧核糖核酸酶（D Nase ，防止膠結(jié)）、蛋白酶（protease ）、EDTA 等；（參考文獻(xiàn)6）

關(guān)于離心分離溫度，有些論文設(shè)在4℃離心分離細(xì)胞效果很好，也有人認(rèn)為初步分離時(shí)溫度應(yīng)保持在20℃以上。（文獻(xiàn)7）

ii. 在梯度液中細(xì)胞過(guò)載：

在密度梯度離心中，每種細(xì)胞的數(shù)量都不能超過(guò)對(duì)應(yīng)于它的密度的梯度液的容量，也就是每種細(xì)胞在梯度液中所占有的梯度層的厚度是受限制的，過(guò)分厚的純樣品區(qū)帶會(huì)與別的細(xì)胞的純樣品區(qū)帶相重疊；這是問(wèn)題的一方面。另一方面，雖然垂直管轉(zhuǎn)頭在高速離心時(shí)，它的離心管縱切面可以容納更多的樣品分子（與甩平轉(zhuǎn)頭的離心管橫剖面相比較），但在離心完成、梯度從垂直方向轉(zhuǎn)換到水平方向后，每個(gè)純樣品所占據(jù)的離心管中心軸上的寬度很大。如果初始樣品中所含的細(xì)胞品種很多，純化后也會(huì)造成純樣品帶的重疊。關(guān)于這個(gè)問(wèn)題沒(méi)有的數(shù)學(xué)計(jì)算，全靠用戶(hù)在實(shí)驗(yàn)中逐漸積累經(jīng)驗(yàn)。這涉及待分離樣品中細(xì)胞的濃度，和梯度離心時(shí)的加樣量（2％～5％離心管容量）以及梯度的形狀（梯度曲線(xiàn)的斜率，連續(xù)梯度或者階梯梯度）等等。

iii. 壁部效應(yīng)：

在角式轉(zhuǎn)頭中沿離心力方向沉降的細(xì)胞接近離心管壁部時(shí)，與在離心力分力作用下沿管壁下滑的細(xì)胞碰撞，造成在角式轉(zhuǎn)頭離心管近外壁部形成了一個(gè)“壁部效應(yīng)區(qū)”，這個(gè)壁部效應(yīng)區(qū)從離心管上部到下部逐漸加寬。由于壁部效應(yīng)，可能會(huì)造成部分細(xì)胞的聚集而影響分離純度，也可能有一小部分細(xì)胞由于碰撞而受損。這種影響在用固定角式轉(zhuǎn)頭作等密度離心時(shí)尤為顯著。所以細(xì)胞離心分離除浮選轉(zhuǎn)頭外一般小容量選擇甩平轉(zhuǎn)頭，大容量選擇區(qū)帶轉(zhuǎn)頭。

iv. 旋渦效應(yīng)：

在加速或減速過(guò)程中在離心管中產(chǎn)生的小旋渦會(huì)影響梯度的完整，在減速過(guò)程中還會(huì)影響已被分離的純樣品帶的寬度，轉(zhuǎn)速500rpm～1000rpm 之間往往在復(fù)合向心力、也就是Coriolis 力的作用下在離心管中會(huì)產(chǎn)生渦旋，渦旋在下列情況下可以減少：

l 增加回轉(zhuǎn)半徑；

l 慢加速和慢減速（根據(jù)不同轉(zhuǎn)頭，不同容量，不同離心方法可以多檔控制的加、減速速率）；
l 縮小離心管直徑（∮10mm 以下，這在大多數(shù)情況下不現(xiàn)實(shí)）；
l 使用一些抗旋渦的緩沖液（文獻(xiàn)5）；
l 應(yīng)用有較陡斜率的密度梯度。

v. 液滴效應(yīng)：

在預(yù)形成密度梯度液上表面加待分離的細(xì)胞樣品，如果不馬上離心，就會(huì)有很少的液滴滴入梯度層。這個(gè)現(xiàn)象在加樣后幾分鐘內(nèi)會(huì)發(fā)生，其結(jié)果是在樣品與梯度液的界面上出現(xiàn)層間擴(kuò)散（文獻(xiàn)8）而影響分離效果，減少這種影響的方法是

l 降低樣品濃度；

l 提高梯度液的初始斜率；

l 在鋪完樣品后立即放入轉(zhuǎn)頭并開(kāi)始離心分離。

vi. 離心力的選擇：

離心力選擇不當(dāng)會(huì)影響細(xì)胞活力改變、細(xì)胞的內(nèi)部構(gòu)造、影響細(xì)胞的裂介和復(fù)制。這種影響常出現(xiàn)在：

l 長(zhǎng)時(shí)間的離心分離過(guò)程；

l 轉(zhuǎn)頭的快加速；

l 過(guò)大的離心力產(chǎn)生了較大的流體靜壓；

l 應(yīng)用較高轉(zhuǎn)速的等密度離心法。

如果我們選用較低的轉(zhuǎn)速，粘度較小的梯度材料（本講座文獻(xiàn)18）；利用細(xì)胞浮選轉(zhuǎn)頭等都可以減少這種影響。

vii．滲透效應(yīng)：

很多細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有堅(jiān)固的細(xì)胞壁，周?chē)慕橘|(zhì)很容易滲透到細(xì)胞內(nèi)部或者細(xì)胞內(nèi)液體反向滲透到周?chē)橘|(zhì)中而引起細(xì)胞的膨脹和收縮，從而改變離心過(guò)程中細(xì)胞的沉降（或上浮）特性。因此配制等滲的梯度液是必要的（講座文獻(xiàn)18）

（二）實(shí)用細(xì)胞離心分離方法舉例

（1） 血細(xì)胞純化：

血細(xì)胞由多種類(lèi)型的但細(xì)胞懸液組成，每種細(xì)胞都有它們自身的特性和功能并廣泛被用于醫(yī)學(xué)臨床和診斷。多年來(lái)研究人員對(duì)血細(xì)胞分離純化作了大量工作，實(shí)驗(yàn)室研究和血液成分分離都已廣泛使用各種離心設(shè)備，如用于醫(yī)學(xué)臨床分析、診斷的全自動(dòng)血細(xì)胞洗滌離心機(jī)（Hitachi MC-450,24 管，Sorvall CW-2,12 管），用于大量血液（標(biāo)準(zhǔn)200ml，300ml，400ml,500ml 三聯(lián)或四聯(lián)血袋）成分分離用的大容量低速、低溫離心機(jī)（參考技術(shù)講座文獻(xiàn)1）等等。下面我們將以實(shí)驗(yàn)室研究為主線(xiàn)，舉例說(shuō)明各種血細(xì)胞分離純化方法。

由B∮yum 研發(fā)并在多年來(lái)被普遍應(yīng)用的血細(xì)胞純化方法是用梯度材料Na-metrizaate 與Ficoll 的混合液作密度梯度離心，把血球中的紅血球，多形核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板分離純化。這種溶液有不同的商品名稱(chēng)如Lymphoprep（Nycomed Pharma 公司）、Ficoll －pague （pharmacia-Biosystems 公司）等，都可以作這一用途。（文獻(xiàn)9）

下面的例子是在室溫下用低速離心機(jī)作血細(xì)胞分離的實(shí)驗(yàn)。

例1．人血中單核（白）細(xì)胞的純化

i.	用抗凝血?jiǎng)┨幚硌獦樱Ｓ每鼓齽?.32％檸檬酸鈉。
ii.	用等容積的生理鹽水稀釋血樣。
iii.	在10ml～15ml 離心管中先注入3ml metrizoate-Ficoll 分離液，在其上鋪6ml 已稀釋
	血樣。
iv.	用甩平轉(zhuǎn)頭600g（1,800~3,000ropm，臺(tái)式機(jī)）×20 分，20℃。（不要在4—5℃低
	溫離心，否則分離效果將很差。
v.	離心后用巴氏移液吸管從血漿與分離液界面中間吸出血細(xì)胞層，其中含有單核（白）
	細(xì)胞和部分血小板。
vi.	加入幾毫升生理鹽水，降低收集的血細(xì)胞濃度。
vii.	同一離心轉(zhuǎn)頭，同一離心管250g（1200rpm 左右）×5 分鐘20℃。可以用同一工
	藝在離心機(jī)中洗幾次。
viii.	收集沉淀在生理鹽水中保存。

例2. 從人血中分離紅細(xì)胞，單核（白）細(xì)胞，中性（白）細(xì)胞

i. 新鮮人血（3～5）ml 用抗凝劑處理。

ii. 15ml 離心管中先注入5ml 分離液Polymorphprep（Nycomed Pharma A/S 公司產(chǎn)品），然后鋪上用抗血凝劑處理過(guò)的人全血5ml 。

iii. 臺(tái)式低速離心機(jī)，甩平轉(zhuǎn)頭，450g（1500～1600rpm）×35 分鐘，18℃～23℃。

iv. 分離結(jié)果：離心管上部近40％液柱為血漿，接下來(lái)一薄層為單核細(xì)胞再下面間隔了少量分離液后又是一薄層中性（白）細(xì)胞，再往下近30％液柱為分離液，紅細(xì)胞在底部（沉淀）。

注意：溫度過(guò)高，或離心力過(guò)大，或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都可能使中性（白）細(xì)胞沉淀。

表：用于人血細(xì)胞分離純化的各種商品分離液（摘自文獻(xiàn)1）

名稱(chēng)	成分	用途	生產(chǎn)商
Lymphoprep	9.6%Na-metrizoate, 5.6% Ficoll	單核細(xì)胞分離	Nycomed-pharma
Ficoll-page	9.6 Na-diatrizoate 5.6% Ficoll	單核細(xì)胞分離	Pharmacia-Biosy-st ems
Nycoprep 1.077	14.1% Nycodenz 0.44% Nacl	單核細(xì)胞分離	Nycomed-pharma
Nycoprep mixer	19.0% Nycodenz 0.2% Nacl	單核細(xì)胞分離	Nycomed-pharma
Nycoprep 1.068	13.0% Nycodenz 0.58% Nacl	單核（白）細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離	Nycomed-pharma
Nycoprep 1.063	12.0% Nycodenz 0.58% Nacl	血小板分離	Nycomed-pharma
Mono-poly Resolving medium	15.5% Na-diatrizoate 8.18% Ficoll	多形核細(xì)胞分離	Flow-Laboratories
Polymorphprep	13.8% Na-metrizoate 8.0% Dextran 500	單核細(xì)胞中性白細(xì)胞紅細(xì)胞分離	Nycomed-pharma

（2） 用等密度離心法分離肝細(xì)胞：

肝細(xì)胞的離心分離在整個(gè)細(xì)胞純化工藝中具有典型性。以鼠肝為例，每克鼠肝中有1.1 ×10⁸個(gè)肝主質(zhì)細(xì)胞（Parenchymal）；10⁷個(gè)肝星形細(xì)胞（Kupffer cell），2×10⁷個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞和1.6×10⁷個(gè)儲(chǔ)脂細(xì)胞。

對(duì)這些肝細(xì)胞的分離純化，研究人員多年來(lái)做了大量實(shí)驗(yàn)研究，下面概述一些典型離心分離實(shí)例：

例3：肝細(xì)胞的連續(xù)密度梯度分離

離心分離工藝需要下列基本設(shè)備，化學(xué)品和溶劑：

l 帶有電磁攪拌器或旋翼攪拌器的密度梯度制備儀；

l 蠕動(dòng)泵，硅膠管（內(nèi)徑1～1.5mm，外徑3mm 左右），有些商品的自動(dòng)梯度制備和收集（如日立DGF-U）本身就帶有蠕動(dòng)泵，硅膠管；

l 帶有恒溫裝置的阿貝折射儀；

l 帶水平轉(zhuǎn)頭的低溫，低速離心機(jī)（臺(tái)式、落地均可）；

l 離心管，是15ml corex 玻璃離心管；

l 平衡鹽溶液GBSS，配置如下：Nacl（8,000mg/l）；KCL（370mg/l）；Mg SO4·7H2O

（70mg/l）；NaH2PO4·2H2O（150mg/l）；Cacl2·2H2O（220mg/l）；NaHCO3（227mg/l）；

KH2PO4（30mg/l）；Mgcl2·6H2O（210mg/l）；葡萄糖（1,000mg/l）；調(diào)節(jié)到PH7.4；

滲透壓275～285mOsm，消毒過(guò)濾后儲(chǔ)存于4℃；

l 28.7％（W/V）Nycodenz 或者30％（W/V）metrizamide 在無(wú)Nacl GBSS 中，滲透壓285 mOsm, PH7.4；

l 竇狀肝細(xì)胞（制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)1，P313 或其他文獻(xiàn)）；
l 0.5％（W/V）臺(tái)酚藍(lán)（trypan blue ）在生理鹽水中；
l 制備過(guò)氧化物酶染色需要的條件（參見(jiàn)文獻(xiàn)10）

分離方法：

i. 從一個(gè)鼠肝中制備（2～3）×10⁶個(gè)肝竇狀細(xì)胞；

ii. 細(xì)胞在15ml GBSS 中洗三次；

iii. 低速離心300g（1200～1300rpm）×5 分鐘，室溫；

iv. 沉淀用6ml GBSS 制成懸液；

v. 制備梯度液和離心分離：

l 將30％（W/V）metrizamide 或28.7％（W/V）Nycodenz（是Nycodenz，因?yàn)樗?nbsp;以高溫滅菌）分別用GBSS 稀釋到20％和19.1％－溶液A

l 用溶液A（metrizamide）（3.1 倍體積）稀釋iv 細(xì)胞懸液，成為8％（W/V）metrizamide 梯度液或用溶液A （Nycodenz）（5.4 倍體積）稀釋iv 懸液，成為7.7％（W/V）Nycodenz 梯度液

l 制備8%~20%metrizamide 或7.7％～19.1％Nycodenz 連續(xù)線(xiàn)性梯度（用本講座中所用各種方法或利用Hitachi DGF-U）

l 用甩平轉(zhuǎn)頭，低溫，低速離心機(jī)，2,000g（約3,400~3,500rpm）×30 分鐘，4℃，

慢加速，慢減速。為了避免細(xì)胞聚集，總離心時(shí)間不要超過(guò)45 分鐘。

Vi．結(jié)果分析

l 用DGF-U，上取法將每個(gè)離心管中溶液分部收集成25～30 管（每管0.3～0.5ml）

l 用阿貝折射儀測(cè)定各管的折射率（RI）并換算成密度

Nycodenz：密度（g/ml）=RI×3.242－3.323 metrizamide：密度（g/ml）= RI×3.453－3.601

l 用0.5％ Trypan 藍(lán)溶介在生理鹽水中與分部收集的細(xì)胞液混合，被染色的細(xì)胞為無(wú)活力細(xì)胞。

l 測(cè)定細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算有活力的細(xì)胞百分比

l 用過(guò)氧化物酶染色反應(yīng)測(cè)定肝星形細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及其他細(xì)胞的分布情況。

l 過(guò)氧化物染色反應(yīng)：

a：分別取每個(gè)分部收集液數(shù)滴（約5×10⁵各細(xì)胞）滴入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液

培養(yǎng)液：15mg DAB（Merck 公司產(chǎn)）溶于15ml 含7％（W/V）蔗糖的0.05M Tris－HCL（PH7.4 , 300 mOsm 中再加入10 30％H2O2，
注意：30 分鐘內(nèi)用完。

b：在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)30 分鐘（也可以用恒溫水槽）

c：培養(yǎng)后低速離心300g×3 分鐘，去上清沉淀用200μl GBSS 稀釋

d：用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定染色細(xì)胞數(shù)量：紅細(xì)胞被染后呈黑色，而肝星形細(xì)胞（Kupffer）

呈深褐色，由于它們大小不同，顏色也可分辨，在計(jì)數(shù)器上很容易鑒別。內(nèi)皮細(xì)胞和

淋巴西哦保保持染色前原色。

e：結(jié)果可以繪成下圖從圖可以看出：

l Kupffer 細(xì)胞在第10 管中占20％，只占總的Kupffer 細(xì)胞的一小部分。在第12～14

管中內(nèi)皮細(xì)胞占50％。

l 從結(jié)果分析，用這種等密度離心法還不能*純化Kupffer 及endothelial 細(xì)胞，而

只能用于一般實(shí)驗(yàn)需要。

例4：肝細(xì)胞的不連續(xù)密度梯度分離

這種方法適用于從肝竇狀細(xì)胞（Sinusoidal）中除去紅細(xì)胞和主質(zhì)細(xì)胞（parenchymal）,離心結(jié)果是讓紅細(xì)胞沉淀，內(nèi)皮細(xì)胞（Sinusoidal）浮上。

實(shí)驗(yàn)需要的基本設(shè)備和溶劑：

l 一臺(tái)帶甩平轉(zhuǎn)頭的低速、低溫離心機(jī)；

l GBSS；

l 在無(wú)NaCl的GBSS中的28.7% Nycodenz或 30% metrizamide

l 15ml塑料離心管；

l 竇狀（Sinusoidal）肝細(xì)胞；

l Trypan藍(lán)染色劑；

l 過(guò)氧化物酶染色劑，及染色需要的設(shè)備；

l 生理鹽水（0.9% NaCl）；

l 固定液：2.5%戊二醛在0.1M二甲基胂酸鈉中（PH7.4）（二甲基胂酸鈉有劇毒，可用0.1M磷酸鹽代替）

l 培養(yǎng)液：（在通風(fēng)柜或生物安全柜中配置）

9.5ml 1.0M NaCl；

11mg 1-乙酸萘脂在0.5ml乙基乙二醇-乙醚中（在氮?dú)庵斜４妫?/div>

0.5ml 1.0M NaCl；

0.25ml 4% 品紅在2.0M HCL中，0.25ml 4% 硝酸鈉在純水中，共計(jì)0.5ml混合；

把以上混合液調(diào)節(jié)到PH7.4，纖維紙過(guò)濾后待用；

注意：30分鐘內(nèi)用完！

離心方法：

i. 準(zhǔn)備10ml Sinusoidal肝細(xì)胞在GBSS中懸液（1～4×10⁸個(gè)細(xì)胞）；

ii. 在懸液中加14ml28.7%（W/V）Nycodenz 或30%（W/V）metrizamide 輕輕混勻；

iii. 將以上溶液分別注入二個(gè)離心管，并在每管液面上緩鋪1-2ml GBSS；

iv. 離心：400gx15分，室溫，不用剎車(chē)，自由滑行減速至停轉(zhuǎn)；

v. 從GBSS 與梯度液之間慢慢地抽吸Sinusoidal 細(xì)胞

vi. 用例2 同樣的方法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量和活力。

vii. 酯酶染色反應(yīng)

l 數(shù)滴細(xì)胞懸液（～0.5×10⁶個(gè)細(xì)胞）滴入1～2ml 固定液，4℃，7 分鐘

l 700g×3 分，低速離心后，去上清，沉淀用0.9％Nacl“洗”二次（在離心機(jī)中，700g×3

分“洗”2 次）

l 取“洗”后沉淀與200μl 0.9％ Nacl 作成懸液，加入等容積培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)染色10 分

鐘

l 用血球計(jì)數(shù)器測(cè)定染色百分比：Kupffer, endothelial 及Parenchymal 細(xì)胞染成紅色，紅

細(xì)胞及淋巴細(xì)胞不被染色，儲(chǔ)脂細(xì)胞微染。

l 結(jié)果可用下表表示

項(xiàng)目		Nycodenz	metrizamide
細(xì)胞產(chǎn)率		43×10⁶	44×10⁶
細(xì)胞活力		99%	99%
細(xì)胞化學(xué)染色	過(guò)氧化物酶染	17%	27%
細(xì)胞化學(xué)染色	酯酶染	71%	80%
細(xì)胞組成：	Kupffer	16%	26%
	endothelial	54%	54%
	儲(chǔ)脂細(xì)胞	10%	1%
紅細(xì)胞		1%	1%
主質(zhì)細(xì)胞		1%	1%
其他細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞）		18%	18%

例5：用雙階梯不連續(xù)梯度部分純化儲(chǔ)脂細(xì)胞，需要的設(shè)備和化學(xué)試劑同例3。

i. 從一只成年雌鼠取肝制成Sinusoidal 細(xì)胞懸液（1～4×10⁸個(gè)細(xì)胞在12ml GBSS 中）

ii. 以6 倍容積的28.7％（W/V）Nycodenz 或30％（W/V）metrizamide 配以4 倍容積的

GBSS 來(lái)稀釋梯度液。取二個(gè)離心管（15ml），每管注入5ml 已稀釋的梯度液（17.2％

Nycodenz 或18％metrizamide）

iii. 將8ml 未稀釋的梯度原液與12ml 細(xì)胞懸液i 輕輕混合，混合后溶液中梯度液濃度為

11.5％Nycodenz 或12％metrizamide

iv. 每個(gè)離心管液柱上鋪5ml 已稀釋的細(xì)胞懸液與梯度液（iii 液），再在液面上鋪1～2ml

GBSS 形成雙階梯不連續(xù)密度梯度。

v. 低速離心1400g（2,700~2,800rpm）×17 分，20℃，無(wú)剎車(chē)，自由滑行至停轉(zhuǎn)。

vi. 用吸管從二個(gè)離心管的低密度界面及高密度界面上分別抽出細(xì)胞層。

vii. 用與例3 同樣的方法測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)率、活力及組成并作成下表：

細(xì)胞名稱(chēng)		細(xì)胞組成
細(xì)胞名稱(chēng)	低密度片斷		高密度片斷
	細(xì)胞數(shù)量（×106）	％	細(xì)胞數(shù)量（×106）	％
儲(chǔ)脂細(xì)胞	52.5	79.6	0.9	0.4
Kupffer	0.7	1.0	45.5	20.3
endothelial	10.9	16.6	129.7	57.9
其他細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞）	1.9	2.8	47.9	21.4
總計(jì)	66	100	224.0	100

（三）用沉降速度法分離細(xì)胞：

利用重力沉降（1g），或低速速率－區(qū)帶密度梯度離心（＜1000×g）也可以純化各

種細(xì)胞。
下面舉一些分離實(shí)例來(lái)說(shuō)明這種方法。主要方法取自參考文獻(xiàn)5，11，12，
用沉降速度法分離細(xì)胞舉例

細(xì)胞樣品	被分離細(xì)胞類(lèi)型	梯度	離心時(shí)間 /RCF（ × g）	設(shè)備	結(jié)果			文獻(xiàn)
細(xì)胞樣品	被分離細(xì)胞類(lèi)型	梯度	離心時(shí)間 /RCF（ × g）	設(shè)備	純度	產(chǎn)率	活力	文獻(xiàn)
白血球	淋巴細(xì)胞（a）單核細(xì)胞（b）	BSA（1.5~6.5%）	9 分/20× g	特制離心室	a）＞ 90％ b）～ 90 ％	a）90％ b）67％	99%	5
白血球	淋巴細(xì)胞（a）單核細(xì)胞（b）	Ficoll（2～4％）	2 小時(shí)/1g	重力沉降室	a）－ b）69 ～ 77％	a）－ b） 28％	＞98 ％	12
白血球	淋巴細(xì)胞（a）單核細(xì)胞（b）	Ficoll （ 3.4 ～ 16.9％）	45 分/800 ×g	低速區(qū)帶轉(zhuǎn)頭	/	/	/	12
預(yù)處理白血球	淋巴細(xì)胞（a）嗜堿性細(xì)胞（b）	Ficoll（4.5～9.5 ％）	15 分/85 ×g	甩平轉(zhuǎn)頭100ml 離心管	a）＞ 95％ b）62 ～ 72％	a）＞ 90％ b）30 ～ 50％	/	11
人骨髓細(xì)胞	CFU-C	Ficoll（2～4％）	2h/1g	重力沉降室	/	/	/	/
預(yù)處理的犬胃細(xì)胞	壁細(xì)胞（a）主細(xì)胞（b）	Ficoll（2～4％）	50 分/1g	重力沉降室	a）＞ 60％ b） 85％	a）～ 50％ b）～ 30％	/	12
竇狀肝細(xì)胞	Kupffer（a） Endothelial（b）	Percoll （3.5~18%）	8 分/16g	特殊沉降室	a） 98％ b） 97％	a） 68％ b） 86％	＞95 ％	5
	Kupffer（a） Endothelial（b）	Percoll （3.5~18%）	8 分/16g	特殊沉降室	a） 98％ b） 97％	a） 68％ b） 86％	＞95 ％	5

（四）細(xì)胞的離心浮選：

利用離心浮選法分離細(xì)胞zui初是在1948 年由Lindahl 提出的，當(dāng)時(shí)取名為“逆流離心” （文獻(xiàn)12）。這個(gè)設(shè)想在上世紀(jì)60 年代中期由Beckman 公司研發(fā)成為商用浮選轉(zhuǎn)頭和浮選離心系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)逐步改進(jìn)發(fā)展成目前的JE－6B（5ml,3,470×g）及JE-5.0（40ML,4,700×g）和Hitachi 的R5E（40ml，5,000rpm ）細(xì)胞浮選系統(tǒng)。現(xiàn)代的浮選分離可以用光學(xué)系統(tǒng)直接在TV 顯示屏上觀(guān)察離心浮選過(guò)程（透明錐形離心室）。

離心浮選法特點(diǎn)：

l 利用細(xì)胞懸浮在錐形離心室內(nèi)受到的離心力，流體阻力和浮力的平衡關(guān)系實(shí)現(xiàn)不同

種類(lèi)細(xì)胞的純化，純度很高。

l 不需要密度梯度；

l 適合分離純化直徑在5～50μm 的細(xì)胞；

l 收集細(xì)胞的數(shù)量可達(dá)10⁷～10¹²個(gè)（JE－5.0 或R5E）；

l 通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)可以觀(guān)測(cè)浮選過(guò)程；

l 可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)收集已純化的細(xì)胞；

l R5E在離心機(jī)門(mén)上有照相機(jī)，記錄浮選過(guò)程；

l 離心浮選室可以高溫消毒（121℃,20分）

離心浮選系統(tǒng)組成：

l Hitachi或Beckman高速冷凍離心機(jī)；

l 離心浮選轉(zhuǎn)頭（日立R5E或貝克曼JE-5.0）；

l 環(huán)氧樹(shù)脂透明離心室；

l 帶流量計(jì)、蠕動(dòng)泵及加樣分配閥的加樣系統(tǒng)；

l 浮選轉(zhuǎn)頭觀(guān)察門(mén)蓋；

l 可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)收集已純化的細(xì)胞；

l 光源組件（裝在轉(zhuǎn)頭下方）；

l TV顯示系統(tǒng).

例6 肝主質(zhì)細(xì)胞倍體級(jí)分離（文獻(xiàn)13）

l 所需設(shè)備同上述。

l 干細(xì)胞浮選用介質(zhì)：L-glutamine（131mg/l）,L-aspartic acid（13.3mg/l）,

L-threonine（23.8mg/l）, L-serine（31.5mg/l）, glycine（37.6mg/l）, L-alanine（53.5mg/l）,

L-glutamic acid（132.4mg/l）, KCL（223.7mg/l）, NaH₂PO₄·H₂O（96.6mg/l）,MgCl₂·6H₂O

（101.7mg/l）, NaHCO₃（2.01g/l）, glucose（3.60g/l）, fructose（3.60g/l）,

Sucrose（67.4mg/l）.溶液調(diào)節(jié)到PH7.4，滲透壓：308mOsm，配置后儲(chǔ)存在－20℃待用。

l 肝主質(zhì)細(xì)胞懸液，從三月齡雌性WAG/Rij 鼠取出；

l trypan 藍(lán)染色劑。

l 結(jié)果：各種倍體細(xì)胞分布

二倍體（2n）		四倍體（4n）		八倍體（8n）		16 倍體（16n）
單核	雙核	單核	雙核	單核	雙核	/
9％	16％	53％	16％	4％	2％	/

例7 鼠肝主質(zhì)細(xì)胞的多倍體級(jí)浮選分離

l 設(shè)備及樣品：同例（5）

l 轉(zhuǎn)速1350rpm（～210g）

l 溫度4℃

l 初始充樣流速12ml/min，直至細(xì)胞充滿(mǎn)離心室

l 分別用流速19，32，41（ml/min）收集I,II,III 細(xì)胞，收集量分別為100ml，150ml 及100ml

l 已收集細(xì)胞儲(chǔ)存于4℃

l 停止輸液后轉(zhuǎn)頭停轉(zhuǎn)，從離心室收集沉淀并收集混合室樣品

l 用低速低溫離心機(jī)甩平轉(zhuǎn)頭分別將收集液離心沉淀，1000×g，10 分鐘，將沉淀與3ml 浮選介質(zhì)混合制成倍體細(xì)胞懸液，4℃保存。

l 結(jié)果：細(xì)胞數(shù)量與活性分析

成分	流量ml/min	細(xì)胞數(shù)量×106	活性（％）	組成
原液		137.8	84	2n，4n，8n，16n 及少量細(xì)胞聚集團(tuán)及細(xì)胞碎片
I	19	39.8	72	2n，4n, 少量細(xì)胞碎片
II	32	54.7	85	4n（90％）
III	41	15.5	83	4n，8n，細(xì)胞聚集團(tuán)
沉淀		17.1	82	同原液數(shù)據(jù)
混合室		5.2	85	同原液數(shù)據(jù)
總數(shù)		127.0（92％）

例8 肝的Kupffer （星形細(xì)胞）及endothelial（ 內(nèi)皮）細(xì)胞純化

l 浮選設(shè)備：同上述例

l 浮選用介質(zhì)：GBSS

l 各種染色介質(zhì)（參考各節(jié)）

l 肝竇狀細(xì)胞（Sinusoidal）懸液

l 分離步驟

i.	用不連續(xù)Nycodenz 梯度制備鼠肝Sinusoidal 細(xì)胞懸液（參見(jiàn)本文前例）
ii.	安裝離心浮選系統(tǒng)（Hitachi 或Beckman）
iii.	標(biāo)準(zhǔn)離心室：3,250rpm，4℃
iv.	初始流量13.5ml/min 注入1～5×10⁸個(gè)細(xì)胞懸液
v.	在流量分別為18，32，48ml/min 時(shí)分別收集100ml，150ml，150ml
	收集液中含有白細(xì)胞（L）、星形細(xì)胞（K）、內(nèi)皮細(xì)胞（E）及主質(zhì)細(xì)胞（P），收集
	液保存在4℃。
vi.	離心后收集在浮選室中的細(xì)胞
vii.	各種收集液離心沉淀：450g×10 分，沉淀分別混懸于3mlGBSS 中

viii. 結(jié)果如下表：

成份	細(xì)胞主要類(lèi)型	細(xì)胞總量×106	活性	染色細(xì)胞比例％		組成％
			％	P1	E1	P	L	E	K
初始細(xì)胞液	Sinusoidal	167.4	87	24.7	86.8	0.6	13.2	61.5	24.7
I 收集液（100ml）	L	19.9	80	3.0	28.6	/	71.4	25.6	3
II 收集液（150ml）	E	82.5	95	9.0	89.2	/	10.8	80.2	9
III 收集液（150ml）	K	34.7	97	83.5	95.1	/	4.9	11.6	83.5
沉淀	細(xì)胞聚集團(tuán)	9.8	95	34.5	96	16.0	4.0	44.6	35.4

注：

l 表成染色比例中 P1：Peroxidase 過(guò)氧化物，E1：Esterrase（酯酶）

l Sinusoidal 細(xì)胞制備方法參見(jiàn)前述內(nèi)容。

例9 鼠肝儲(chǔ)脂細(xì)胞的離心浮選純化（文獻(xiàn)14）

i.	離心浮選設(shè)備（同上）
ii.	轉(zhuǎn)速3,250rpm，4℃，流量16ml/min
iii.	Sinusoidal 細(xì)胞制備參照前述二階不連續(xù)梯度離心法。
iv.	加樣：5～50×107 個(gè)細(xì)胞注入混合室
v.	用16ml/min 及18ml/min 分別收集二次，zui后收集在離心室中剩下的細(xì)胞液
vi.	以上三種收集液分別450g×10 分鐘離心，收集沉淀后分別用2mlGBSS 混成
	懸液

結(jié)果如下表：

成份	細(xì)胞主要類(lèi)型	細(xì)胞總量×10⁶	活性％	染色細(xì)胞比例％			組成％
				P	E1	F	L	E	K
初始樣品	E.F	133	94	8	98	16	2	75	8
F1	F	14	80	1	88	78	12	9	/
F2	F	6	85	1	94	53	6	40	/
沉淀	E	108	93	1	99	7	/	81	11

注：①E：endothelal Cell ②初始樣品取12 月齡鼠肝，二步不連續(xù)梯度分離后取上層

F：Fat-storing Cell

P1：Peroxidase

E1：Esterrase

L：Lymphocytes

K：Kupffer

例10 用離心浮選法從人血中純化單核白細(xì)胞

l 離心浮選設(shè)備同上述

l 浮選前、后處理需要低速低溫離心機(jī)50ml 甩平轉(zhuǎn)頭

l 浮選用液：含25mM 葡萄糖及1％（W/V）BSA 的磷酸緩沖液

l 酯酶（Esterrase）染色所需設(shè)備及試劑

l 肝素化（利用肝素增加血液凝固時(shí)間）人血（50ml）

l 梯度材料Ficoll-Pague （Pharmacia-Biosystems）

Lymphoprep （Nycomed Pharma，A/S）

l 磷酸鹽緩沖液（PBS）（50mM，PH7.4）

分離步驟：

i.	用例（1）的方法從50ml 血樣中純化單核細(xì)胞，從分界面收獲細(xì)胞液，加浮選
	液后容積為5ml 。
ii.	安裝離心浮選系統(tǒng)，用浮選液充滿(mǎn)浮選離心室，設(shè)置5℃。
iii.	預(yù)置轉(zhuǎn)速2,030rpm, 設(shè)定流量4.7ml/min
iv.	加入樣品（1×108 個(gè)細(xì)胞），離心，分九次收集，每次50ml 分別用流量4.7，8.0，
	10.0，11.0，12.0，12.7，13.5，14.5，16ml/min 收集。
v.	收集后的細(xì)胞樣品分別用450g×10 分收集沉淀。
vi.	將以上沉淀分別用3ml 浮選液稀釋成懸液
vii.	Esterrase 染色后計(jì)數(shù)
	結(jié)果如下表：

成份	流量（ml/min）	細(xì)胞數(shù)量（×10⁶）	酯酶染色
成份	流量（ml/min）	細(xì)胞數(shù)量（×10⁶）	負(fù)染（％）	正染（％）
原液	/	104	85.6	14.4
1	4.7	0	/	/
2	8.0	3	100	0
3	10.0	17.8	99.7	0.3
4	11.0	25.0	99.3	0.7
5	12.0	25.0	98.0	2.0
6	12.7	10.8	95.2	4.8
7	13.5	1.2	95.3	4.7
8	14.5	0.8	84.5	15.5
9	16	2.0	58.7	41.3
沉淀	/	10.0	28.4	71.6

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